一、原理
生化需氧量是指在规定条件下，微生物分解存在于水中的某些可氧化物质，主要是有机物质所进行的生物化学过程中消耗溶解氧的量。分别测定水样培养前的溶解氧含量和在20±1℃培养五天后的溶解氧含量，二者之差即为五日生化过程所消耗的氧量（BOD5）。
二、仪器
1．恒温培养箱。
2．5—20L细口玻璃瓶。
3．1000—2000mL量筒。
4．玻璃搅棒：棒长应比所用量筒高度长20cm。在棒的底端固定一个直径比量筒直径略小，并带有几个小孔的硬橡胶板。
5．溶解氧瓶：200—300mL，带有磨口玻璃塞并具有供水封用的钟形口。
6．虹吸管：供分取水样和添加稀释水用。
三、试剂
1．磷酸盐缓冲溶液：将8.5g磷酸二氢钾（KH2PO4），21.75g磷酸氢二钾(K2HPO4)，33.4g磷酸氢二钠(Na2HPO4·7H2O)和1.7g氯化铵(NH4Cl)溶于水中，稀释至1000mL。此溶液的pH应为7.2。
2．硫酸镁溶液：将22.5g硫酸镁 (MgSO4·7H2O) 溶于水中，稀释至1000mL。
3．氯化钙溶液：将 27.5g无水氯化钙溶于水，稀释至1000mL。
4．氯化铁溶液：将0.25g氯化铁(FeCl3·6H2O)溶于水，稀释至1000mL。
5．盐酸溶液(0.5mol/L):将40mL(ρ=1.18g/mL)盐酸溶于水中，稀释至100mL。
6．氢氧化钠溶液(0.5mol/L)：将20g氢氧化钠溶于水，稀释至1000mL。
7．亚硫酸钠溶液(c1/2Na2SO3=0.025mol/L)：将1.575g亚硫酸钠溶于水，稀释至1000mL。此溶液不稳定，需每天配制。
8．葡萄糖-谷氨酸标准溶液：将葡萄糖(C6H12O6)和谷氨酸(HOOC－CH2－CH2－CHNH2－COOH)在103℃干燥1h，各称取150mg溶于水中，移入1000mL容量瓶内并稀释至标线,混合均匀。此标准溶液临用前配制。
9．稀释水：在5—20L玻璃瓶内装入一定量的水，控制水温在20℃左右。然后用无油空气压缩机或薄膜泵，将此水暴气2—8h，使水中的溶解氧接近于饱和，也可以鼓入适量纯氧。瓶口盖以两层经洗涤晾干的纱布，置于20℃培养箱中放置数小时，使水中溶解氧含量达8mg/L左右。临用前于每升水中加入氯化钙溶液、氯化铁溶液、硫酸镁溶液、磷酸盐缓冲溶液各1mL，并混合均匀。
稀释水的PH值应为7.2，其BOD5应小于0.2mg/L。
10．接种液：根据所取水样用不同的方法获取适用的接种液。
11．接种稀释水：取适量接种液，加于稀释水中，混匀。每升稀释水中接种液加入量生活污水为1—10mL，表层土壤浸出液为20—30mL；河水、湖水为10—100mL。
接种稀释水的pH值应为7.2，BOD5值以在0.3—1.0mg/L之间为宜。接种稀释水配制后应立即使用。
四、测定步骤
1．水样的预处理
（1）水样的pH值若超出6.5—7.5范围时，可用盐酸或氢氧化钠稀溶液调节至近于7，但用量不要超过水样体积的0.5%。若水样的酸度或碱度很高，可改用高浓度的碱或酸液进行中和。
(2)水样中含有铜、铅、锌、镉、铬、砷、氰等有毒物质时，可使用经驯化的微生物接种液的稀释水进行稀释，或增大稀释倍数，以减小毒物的浓度。
(3)含有少量游离氯的水样，一般放置1—2h，游离氯即可消失。对于游离氯在短时间不能消散的水样，可加入亚硫酸钠溶液，以除去之。其加入量的计算方法是：取中和好的水样100mL，加入1+1乙酸10mL，10%（m/V）碘化钾溶液1mL,混匀。以淀粉溶液作指示剂，用亚硫酸钠标准溶液滴定游离碘。根据亚硫酸钠标准溶液消耗的体积及其浓度，计算水样中所需加亚硫酸钠溶液的量。
(4)从水温较低的水域中采集的水样，可遇到含有过饱和溶解氧，此时应将水样迅速升温至20℃左右，充分振摇，以赶出过饱和的溶解氧。
从水温较高的水域或废水排放口取得的水样，则应迅速使其冷却至20℃左右，并充分振摇，使与空气中氧分压接近平衡。
2．水样的测定
（1）不经稀释水样的测定：溶解氧含量较高、有机物含量较少的地面水，可不经稀释，而直接以虹吸法将约20℃的混匀水样转移至两个溶解氧瓶内，转移过程中应注意不使其产生气泡。以同样的操作使两个溶解氧瓶充满水样，加塞水封。
立即测定其中一瓶溶解氧。将另一瓶放入培养箱中，在20±1℃培养5d后。测其溶解氧。
（2）需经稀释水样的测定
稀释倍数的确定：地面水可由测得的高锰酸盐指数乘以适当的系数求出稀释倍数（见下表）。
高锰酸盐指数（mg/L）
系 数
＜5
5—10
10—20
＞20
——
0.2、0.3
0.4、0.6
0.5、0.7、1.0
工业废水可由重铬酸钾法测得的COD值确定。通常需作三个稀释比，即使用稀释水时，由COD值分别乘以系数0.075、0.15、0.225，即获得三个稀释倍数；使用接种稀释水时，则分别乘以0.075、0.15和0.25，获得三个稀释倍数。
稀释倍数确定后按下法之一测定水样。
①一般稀释法：按照选定的稀释比例，用虹吸法沿筒壁先引入部分稀释水（或接种稀释水）于1000mL量筒中，加入需要量的均匀水样，再引入稀释水（或接种稀释水）至800mL，用带胶板的玻璃棒小心上下搅匀。搅拌时勿 使搅棒的胶板露出水面，防止产生气泡。
按不经稀释水样的测定步骤，进行装瓶，测定当天溶解氧和培养5d后的溶解氧含量。
另取两个溶解氧瓶，用虹吸法装满稀释水（或接种稀释水）作为空白，分别测定5d前、后的溶解氧含量。
②直接稀释法：直接稀释法是在溶解氧瓶内直接稀释。在已知两个容积相同（其差小于1mL）的溶解氧瓶内，用虹吸法加入部分稀释水（或接种稀释水），再加入根据瓶容积和稀释比例计算出的水样量，然后引入稀释水（或接种稀释水）至刚好充满，加塞，勿留气泡于瓶内。其余操作与上述稀释法相同。
在BOD5测定中，一般采用叠氮化钠改良法测定溶解氧。如遇干扰物质，应根据具体情况采用其它测定法。溶解氧的测定法附后。
五、计算
1．不经稀释直接培养的水样
BOD5(mg/L)=c1－c2
式中：c1——水样在培养前的溶解氧浓度(mg/L);
c2——水样经5d培养后，剩余溶解氧浓度(mg/L);
2．经稀释后培养的水样
BOD5(mg/L)= ( (c1–c2)–(B1–B2)f1)/f2
式中：B1——稀释水（或接种稀释水）在培养前的溶解氧浓度(mg/L);
B2——稀释水（或接种稀释水）在培养后的溶解氧浓度(mg/L);
f1——稀释水（或接种稀释水）在培养液中所占比例；
f2——水样在培养液中所占比例。
注意事项
1．测定一般水样的BOD5时，硝化作用很不明显或根本不发生。但对于生物处理池出水，则含有大量硝化细菌。因此，在测定BOD5时也包括了部分含氮化合物的需氧量。对于这种水样，如只需测定有机物的需氧量，应加入硝化抑制剂，如丙烯基硫脲（ATU,C4H8N2S）等。
2．在两个或三个稀释比的样品中，凡消耗溶解氧大于2mg/L和剩余溶解氧大于1mg/L都有效，计算结果时，应取平均值。
3．为检查稀释水和接种液的质量，以及化验人员的操作技术，可将20mL葡萄糖-谷氨酸标准溶液用接种稀释水稀释至1000mL，测其BOD5，其结果应在180—230mg/L之间。否则，应检查接种液、稀释水或操作技术是否存在问题。